2013医学检验辅导：放射免疫分析的基本原理

　　放射免疫分析的基本原理是标记抗原(Ag*)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)的竞争结合反应。它的反应式为：

　　在这一反应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的。抗体的量一般取用能结合40%～50%的标记抗原，而受检标本中的非标记抗原是变化的。根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应结果。

　　假设受检标本中不含抗原时的反应条件为：

　　4(Ag*)+2(Ab)→2(Ag*Ab)+2(Ag*)(2)

　　在标本中存在抗原时，举例如下：

　　4(Ag*)+4(Ag)+(2Ab)→

　　1(Ag*Ab)+3(Ag*)+1(AgAb)+3(Ag)(3)

　　当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统时，由于标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，因此两者相互竞争结合特异性抗体。由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比(图16-1)。若将抗原抗体复合物与游离标记抗原分开，分别测定其放射性强度，就可算性结合态的标记抗原(B)与游离态的标记抗原(F)的比值(B/F)，或算出其结合率[B/(B+F)]，这与标本中的抗量呈函数关系。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线(图16-2)。受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。

　　(一)标记物

　　标记用的核素有放射γ射线和β射线两大类。前者主要为131I、125I、57Cr和60Co;后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。例如125I比活性的理论值是64.38×104GBq/g(1.74×104Ci/g)，有较长半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g(4.5Ci/g)。两者相比，1mol125I或14C结合到抗原上，125I的敏感度约比14C大3900倍。又因为125I有合适的半衰期，低能量的γ射线易于标记，因而125I是目前常用的RIA标记物。

　　(二)标记方法

　　标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。

　　直接标记法是将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上。此法优点是操作简便，为125I和蛋白质的单一步骤的结合反应，它能使较多的125I结合在蛋白质上，故标记物具有高度比放射性。但此法只能用于标记含酪氨酸的化合物。此外，含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性，则该活性易因标记而受损伤。

　　间接标记法(又称连接法)是以125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。由于操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。但此法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质。如直接法标记引起蛋白质酪氨酸结构改变而损伤其免疫及生物活性时，也可采用间接法。它的标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失。下面介绍最常用的氯胺T直接标记法。

　　氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐，在水溶液中逐渐分解形成次氯酸，是一种氧化剂。在偏碱溶液中(pH7.5)，氯胺T将125I的I-氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。反应式如下：

　　放射性碘标记率的高低与抗原(蛋白质或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有关，当分子中含有较多的酪氨酸，又暴露在外时，则标记率就高。

　　标记方法：将纯化抗原和125I加入小试管底部，然后将新鲜配制的氯胺T快速冲入，混匀振荡数十秒～2min后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加入KI溶液稀释。然后在葡聚糖G柱上分离，逐管收集。分别用井型闪烁计数器测定放射性强度(脉冲数/min,cpm)，前部为标记抗原峰，后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管内加等量1%白蛋白作稳定剂，此即为标记抗原液。

　　(三)标记物的鉴定

　　1.放射性游离碘的含量用三氯醋酸(预先在受鉴定样品中加入牛血清白蛋白)将所有蛋白质沉淀，分别测定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游离碘在总放射性碘的5%以下。标记抗原在贮存过久后，会出现标记物的脱碘，如游离碘超过5%则应重新纯化去除这部分游离碘。

　　2.免疫活性标记时总有部分抗原活性损失，但应尽量避免。检查方法是用小量的标记抗原加过量的抗体，反应后分离B和F，分别测定放射性，算出BT%。此值应在80%以上，该值越大，表示抗原损伤越少。

　　3.放射性比度标记抗原必须有足够的放射性比度。比度或比放射性是指单位重量抗原的放射强度。标记抗原的比放射性用mCi/mg(或mCi/mmol)表示。比度越高，测定越敏感。标记抗原的比度计算是根据放射性碘的利用率(或标记率)：

　　如：5μghGH用2mCiNa125I进行标记，标记率为40%，则

　　(四)抗血清的检定

　　含有特异性抗体的抗血清是放射免疫分析的主要试剂，常以抗原免疫小动物诱发产生多克隆抗体而得。抗血清的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。抗血清质量的指标主要有亲和常数、交叉反应率和滴度。