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多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂,因此直接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的,多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段,然后再行分析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要问题,它要求裂解点少,选择性强,而且反应产率高,目前主要有化学法和酶解法两类。
1)化学法
(1)溴化氰法 是最理想的化学方法,能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键
溴化氢化学降解法其优点:
①一般蛋白质含甲硫氨酸较少,由此可获得大片段
②专一性强
③产率高达80%以上
④作用条件温和,在室温中用几到十几小时即可。
(2)部分酸水解法
Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此法,即用0.1N盐酸在110℃或用6N盐酸在37℃水解。这种部分酸水解的方法特异性不强,因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。
(3)羟胺法
这种方法近十年来开始受人注意,羟胺能专一性地裂解AsnGly的肽键,酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。已用于某些蛋白质的分析。
(4)N-溴代琥珀酰亚胺法
主要裂解Try处的肽键,五十年代研究较多。但由于它也能断裂TyrHis肽键,因此应用不广。
2)酶解法
酶水解法较化学法具有更多的优越性,使用也更广泛。因其具有较高专一性,而且水解产率较高,所以可以选择各种不同专一性的酶进行专一性的断裂。
常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
胰蛋白酶专一断裂Lys,Arg的羧基侧肽键,如果对Lys,Arg,CysH进行化学修饰可改变胰蛋白酶的断裂性质。
(1)赖氨酸的修饰。将Lys用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸杆修饰,则胰蛋白酶仅使Arg肽键断裂。
顺丁烯衍生物在中性pH下稳定,胰蛋白酶水解仅使Arg键断裂。在酸性条件下顺丁烯衍生物可脱去封闭,此时再行胰蛋白酶水解,则得赖氨酸为末端的多肽。下述为蛋白质中的赖氨酸,经顺丁烯酰化作用后,被胰蛋白酶水解的例子。
(2)精氨酸的修饰。精氨酸与1,2-和1,3-二羰化合物作用,缩合产物是一杂环化合物,十分稳定。然后胰酶水解仅断裂赖氨酸残基末端的肽键
(3)半胱氨酸的修饰。若肽链内Lys、Arg均较少,则为了增加胰酶的裂解点,可以将半胱氨酸进行氨乙基化,其产物Sβ氨乙基半胱氨酸有类似Lys的结构,胰蛋白酶在水解时,不能识别这微细的变化,从而在半胱氨酸处断裂。
蛋白水解酶的专一性
酶 | 米源 | 主要作用点 | 其它作用点 |
胰蛋白酶 | 胰 | Arg,Lys | |
糜蛋白酶 | 胰 | Tyr,Phe,Trp | Leu,Met,His,Asu,Gln |
弹性蛋白酶 | 胰 | Leu,Ile,Ala | 其它等 |
胃蛋白酶 | 胃粘膜 | Tyr,Phe,Trp,Met,Len | Ala,Glu,Asp,其它等 |
木瓜蛋白酶 | Papayplant木瓜植物 | Arg,Lys,Gly | 其它等 |
嗜热菌蛋白酶 | 嗜热解蛋白芽孢杆菌 | Leu,Ile,Phe | Val,Tyr |
枯草杆菌蛋白酶 | 枯草杆菌 | 芳香族及脂肪族残基 |
肽链的裂解和重组大致有三种情况:一种是非特异性裂解,如酸水解。由于裂解的片段较小,造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解,采用两种以上的专一裂解,然后进行组合,这种方法一般也适用于分子量小于5万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解,首先将某种氨基酸进行化学修饰,使水解酶专一断裂某一种氨基酸,分成若干片段,然后解除化学封闭,再用此酶裂解,使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。
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