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在蛋白质一级结构的测定中,肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法和酶解法两种。
1)化学法Edman降解法
这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始,逐步降解。将肽先与异硫氰酸苯酯(PTH试剂)在pH8-9条件下作用,肽的NH2末端接到异硫氰酸苯酯的C原子上生成苯异硫甲氨酰肽,简称PTC肽,在强酸作用下,可使靠近PTC基的氨基酸环化,肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏,因而又可出现一个新的N-末端。重复以上的步骤,继续与PTH试剂作用,继续分析,苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定,在水中可转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)。这些步骤通常称为Edman氏逐步降解法。所以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少,灵敏度高。
PTH-氨基酸的鉴定可以用各种层析方法,如纸层析、薄层层析、气相层析和质谱法等,现在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点,但是由于操作繁琐,工作量大,所以目前有人根据Edman降解的原理作一系列改进。
下面简单介绍几种方法
A.1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置,使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜,使之固定。然后与PITC试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂,因而样品易丢失,且仪器昂贵,使用受到限制。
B.1970年Laursen改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少,检出灵敏,可分析20?0肽,其原理是将肽共价结合到惰性支持物上,固定后装柱再行Edman降解。
固相顺序仪的惰性支持物有:
此法成功的关键是肽段的固定,目前采用C端α羧基固定法,重复法高,其中以高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好,固定率可达90-95%。
C.另外也有从化学反应的角度考虑,试图改进Edman方法。1976年有人将异硫氰酸苯酯的苯基改变为甲氨偶氮苯,试剂为甲氨偶氨苯异硫氰酸盐(简称DABITC)。这是一种有色试剂,产物DABIH氨基酸呈桔黄色,因此鉴定时无需染色,用肉眼即可分辨。此方法灵敏度很高,一次分析小肽段只要几个nanomole样品即可,是目前一种很可取的方法。此外也有人将异硫氰酸酯进行35S标记,使分析样品更向微量化方向发展。
2)酶解法肽谱重迭法
分析肽段也可采用酶解法,利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽,比较两种方法所得之肽段的重复性,进行氨基酸顺序的装配。例如,有一个肽段,通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜蛋白酶水解,则得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡肽。分析结果如下:
Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)
胰蛋白酶水解
Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
将此两套寡肽可以做分析比较,因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val,因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下
寡肽号 | 氨基酸组成部分顺序 |
A-1 | Ala·Pha |
B-1 | Ala·Phe·Gly·Lys |
A-2 | Gly·Lys·Asn·Tyr |
B-2 | Asn·Tyr·Arg |
A-3 | Arg·Trp |
B-3 | Trp·His·Val |
A-4 | His·Val |
+肽顺序 | Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val |
水解酶也可运用二肽酶,两组可用同一种酶水解如第一套肽是A桞,C桪,E桭,G桯……第二套肽水解则先将该肽段N端切去一个末位氨基酸,然后再开始二肽酶断裂,结果是A,B桟,D桬,F桮……这样分析比较也可排列出肽段顺序。
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