2012临床执业医师微生物学辅导：细菌感染的诊断

2012临床执业医师微生物学辅导：细菌感染的诊断

　　一、检测细菌或其抗原

　　(一)直接涂片显微镜检查

　　自病人标本直接涂片作染色镜检是简便而快速的方法之一。自一定部位采集标本作直接检查需考虑细菌的形态特征与可能存在的细菌数量。脑膜炎患者的脑脊液和瘀斑刺破涂片，常可显示在细胞内的革兰氏阴性肾形双球菌，有诊断价值。白喉患者咽部假膜涂片中可见典型的杆菌有时可有异染颗粒，也有参考诊断价值。结核患者痰直接或浓集后，涂片抗酸染色检出结核杆菌有诊断价值。在少数情况下，也有利用免疫荧光或酶标记抗体染色镜检方法进行快速诊断，如粪例中的霍乱弧菌、痢疾杆菌等，可用这种技术检出。

　　(二)培养

　　大多数病菌的形态与染色并无特征，因此需用培养方法来分离与鉴定细菌。虽然这一方法需要的时间较长，但比较可靠。此外，只有通过这一方法才能获得细菌的纯培养，可用于做药敏试验或毒力试验。应根据不同细菌需要的营养、生长条件(如厌氧或CO2)、菌落生长特征来初步识别细菌。如溶血性链球菌需在血琼脂平板上生长，菌落小而透明，菌落周围有完全溶血圈，可资鉴别。多数细菌欲确定为何种病原菌尚需进一步获得纯培养及接种各种特殊培养基进行生化反应试验或确定其抗原性与致病力等。

　　(三)生化反应

　　细菌的合成与分解代谢过程中，能通过酶利用一些物质或分解一些物质。不同的细菌具有不同的酶，因此各种细菌能够利用与分解的物质也各不相同。利用各种细菌的不同生化反应帮助鉴别细菌在某些细菌如肠道杆菌中是很重要的步骤。例如肠道杆菌均为革兰氏阴性杆菌。菌落形态亦相似，但对于糖的发酵结果不同，因此可利用不同种糖作为培养基质进行生化反应予以区别。

　　(四)抗原检测与分析

　　有些细菌即使用生化反应变难区别，但其细菌抗原成份(包括菌体抗原、鞭毛抗原)却不同。利用已知的特异抗体测定有无相应的细菌抗原可以确定菌种或菌型。常用的方法为玻片凝集反应，用已知的特异免疫血清与待鉴定的细菌在玻片上做凝集反应，如出现凝集菌团则为阳性，说明该菌有相应的特异抗原。近年采用了各种检测抗原的敏感方法，如对流免疫电泳、放射免疫、酶免疫、气相色谱等方法，试图直接从患者标本中检测细菌抗原作快速诊断。如果在细菌性脑膜炎中，利用对流免疫电泳在脑脊液中可分别检测肺炎球菌、脑膜炎球菌及流感杆菌，特异性高，敏感性亦高。气相色谱方法系列利用细菌代谢产生的挥发性短链有机酸，进行气相色谱分析可鉴别细菌，这在厌氧菌中应用很广。检测抗原的另一优点为在应用了抗生素治疗后，细菌生长被抑制，利用培养方法不能检出的细菌，因尚有抗原存在，在短期内仍可被检出，从而有助于明确病因。个别情况下还可利用噬菌体对细菌抗原型别分析，用于流行病学追踪调查。

　　二、检测抗体

　　人体受病菌感染后，经一定时间产生抗体，抗体的量随病菌感染过程而增多，表现为效价升高。因此用已知的细菌或抗原检测患者体液(主要为血清)中有无相应抗体及抗体量的动态变化，可辐助诊断。一般采用血清进行试验，故又称为血清学试验。血清学试验适用于抗原性较强的病原菌及病程较长的传染病诊断。

　　正常人如已经受过某些病原菌隐性感染或近期进行过预防接种，血清中可能含有对该种病原菌的一定量的抗体，因此必须有抗体效价升高或随病程递增才有参考价值。例如伤寒患者血清抗体的检查称为肥达氏试验(Widal test，即将患者血清不同稀释后，与伤寒、副伤寒菌抗原在试管中做凝集反应。根据最高血清稀释度仍有明显凝集的血清抗体效价，结合患者具体情况作为诊断。多数血清学试验的诊断需取患者双份血清，即一份在疾病的急性期，另一份在恢复期(一般为2～6周后)，当抗体效价升高4倍以上方有诊断价值。因此血清学诊断主要为病后的回顾性诊断。但目前有利用检测某些细菌某些细菌特lgM抗体的早期诊断方法。此外，在检测测抗体时至少应有怀疑可能致病细菌的线索方可采用相应抗原，否则就无从选择做何种血清学试验。有些患者因早期使用抗生素治疗，细菌在体内繁殖不多，患者可不产生抗体，因而并非每一患者均有抗体效价升高的表现。然而当病原菌未能被检出时，有些患者仍可通过血清抗本效价的升高予以诊断，因此检测细菌是互相辅助的诊断方法。

　　三、检测细菌遗传物质

　　通过检测病原体遗传物质来确认病原体也许是检查病原体为直接的方法了。目前比较成熟的技术包括基因探针技术和PCR技术。

　　(一)基因探针技术

　　用标记物标记细菌染色体或质粒DNA上的特异性片段制备成细菌探针，待检标本经过短时间培养后，经过点膜、裂解变性、预杂交和杂交后，利用探针上标记物发出的信号可以知道杂交结果并判断病原体的性质。基因探针技术操作比较复杂，加之同位素污染等问题，目前尚不能普及应用。近年来发展起来的地高辛标记的非同位素探针，从探针标记到杂交都很方便，只是价格昂贵，仍限于科研应用，尚不能普及。

　　(二)PCR技术

　　这是八十年代末发展起来的一项极有应用价值的技术，设计病原体基因的特异引物，细菌标本(不经培养)经过简单裂解、变性后，就可在PCR仪上进行扩增反应，经过25～30个循环，通过琼脂糖电泳即可观察扩增结果，检出病原体。这种技术的特点是简便、快速。它尤其适于那些培养时间较长的病原菌的检查，如结核杆菌、支原体等。PCR高度的敏感性使该技术在病原体诊断过程中极易出现假阳性，避免污染是提高PCR诊断准确性的关键环节。

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