2013年药学类辅导：病毒核酸及抗原的直接检出

　　(一)直接检出病毒核酸

　　1.标本滴加到硝酸纤维素膜上，病毒DNA结合到膜上，在原位进行硷变性处理后，有放射标记的已知病毒DNA片段杂并，两条单股核酸按硷基到补原则结合成双股，经放射自显影，阳性结果出现斑点状杂交信号。含轮状病毒的粪便标本经热变性处理，点到膜上，使用轮状病毒体外转录的放射标记探针做斑点杂交，敏感性高于ELISA。肠道病毒也可用互补的DNA探针做斑点杂交。

　　目前核酸分子杂交不但用来检测急性病人标本中的病毒DNA，也用于检测不易分离培养的慢性感染、潜伏感染、整合感染病人标本中的病毒DNA。

　　2.多聚酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR) 一种体外基因扩增法。先将待检标本DNA热变性为单股DNA做为模板，加一对人工合成的与模板DNA两端各20个硷基互补的引物，在耐热DNA多聚酶作用下，使四种脱氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA链，经20～40个循环，可使1个拷贝的核酸扩增至106以上，经琼脂糖电泳，可见到溴化乙锭染色的核酸条带，扩增片段的大小取决于两引物的间距。此法较核酸杂交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、疱疹病毒感染诊断，尤其适用于不易分离培养及含量极少的病毒标本，有较大应用前景。

　　(二)直接检测病毒抗原

　　1.免疫荧光(IF)技术如前所述IF可用于细胞培养病毒的鉴定，也适用检测临床标本中病毒抗原，具有快速、特异的优点。直接免疫荧光技术是用荧光素直接标记特异性抗体，检测病毒抗原;间接免疫荧光技术是先用特异性抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的抗体与特异性抗体结合，从而间接识别抗原。可取咽喉脱落细胞，检测呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原;取病灶刮片或脑活检标本，检测单纯疱疹病毒抗原;取尿沉渣检测巨细胞病毒抗原等。近年来使用单克隆抗体大大提高了检测的灵敏度和准确性。

　　2.免疫酶法(IEA)原理与应用范围同免疫荧光技术，IEA是用酶(通常是过氧化物酶)取代荧光素标记抗体，酶催化底物形成有色产物，在普通光学显微镜下清晰可见，不需荧光显微镜，便于推广使用。

　　3.放射免疫测定法(RIA)有竞争RIA和因相RNA二种方法。竞急RIA是同位素标记的已知抗原与标本中未标记的待检抗原竞争性结合特异性抗体的试验，将形成的复合物分离出来，用放射免疫检测仪测定放射活性，同时与系列稀释的标准抗原测定结果进行比较，确定出待检抗原的浓度。因相RIA是用特异性抗体包被因相以捕获标本中的抗原，然后加入放射性标记的特异性抗体与抗原结合，测定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于测定粪便中甲肝病毒、轮状病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

　　4.酶联免疫吸附试验(ELISA)先将特异性抗体包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉标本中相应抗原，然后加入酶标特异性抗体，相应抗原被夹在抗体之间，当加入酶的底物后显色，显色程度直接反映了标本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接触放射性物质，已被多数实验室采用。

　　此外，对难以分离培养，形态特殊且病毒数量较多的标本，可用电镜或免疫电镜法直接观察，是一种快速诊断与鉴定病毒的方法，如轮状病毒、乙肝病毒。