2013药学类微生物学辅导：病毒的分离与鉴定

　　(一)病毒的分离

　　病毒分离的一般程序是：

　　无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚;无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种;咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。

　　1.细胞培养 用分散的活细胞培养称细胞培养(Cell culture)。所用培养液是含血清(通常为胎牛血清)、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。

　　原代细胞培养(Primary cell culture)用胰蛋白酶将人胚(或动物)组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。

　　二倍体细胞培养(Diploid cell cultune)原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞(如WI-38细胞系)。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮(-196℃)内，做为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。

　　传代细胞培养 (Continous cell culture)通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来(如 Hela 、Hep-2、 Vero细胞系等)，染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用。

　　表23-3 病毒增殖用部分细胞系及来源

　　淋巴细胞培养(Lymphocyte culture)正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T细胞生长因子(IL-2)后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒(HIV、HTLV)提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。

　　2.动物试验这是最原始的病毒分离培养方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，可接种鼻内、皮内、脑内、皮下、腹腔或静脉，例如嗜神经病毒(脑炎病毒)接种鼠脑内，柯萨奇病毒接种乳鼠(一周龄)腹腔或脑内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。

　　3.鸡胚培养用受精孵化的活鸡胚培养病毒比用动物更加经济简便。根据病毒的特性可分别接种在鸡胚绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黄囊、脑内或静脉内，如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分离培养;但很多病毒在鸡胚中不生长。

　　(二)分离病毒的鉴定

　　1.病毒在细胞内增殖的指征

　　(1)细胞致病作用(Cytopathogeniceffect,CPE)病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变，结合临床表现可做出预测性诊断(表23-4)。免疫荧光(IF)法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。

　　表23-4 病毒在细胞内增殖的指征

　　(2)红细胞吸附现象(Hemadsorptionphenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24-48小时，以细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。

　　(3)干扰现象(Interference phenomenon)一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒(如风疹病毒)但能干扰以后进入的病毒(如ECHO病毒)增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。

　　2.病毒感染性的定量测定

　　空斑形成单位 (Plaque-forming unit ,PFU)测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位(PFU)来表示。

　　(2)50%致死量(LD50)或50%组织细胞感染量(TCID50)的测定本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚，易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚，易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。

　　3.病毒形态与结构的观察病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属那一科。还可用分子生物学技术分析病毒核酸组成、基因组织构、序列同源性比较加以鉴定。

　　4.血清学鉴定用已知的诊断血清来鉴定。补体结合试验可鉴定病毒科属;中和试验或血凝捣蛋制试验可鉴定病毒种、型及亚型。从病人检材中分离出病毒株，应结合临床症状，检材来源及流行季节等加以综合分析，并应注意混杂病毒、隐性感染或潜伏病毒的混淆，须用病人急性期与恢复期双份血清作血清学试验，血清抗体滴度有≥4倍以上增高，才有意义。